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多環(huán)芳烴(polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)是環(huán)境中普遍存在的一類重要的持久性有機(jī)污染物，其濃度水平與污染特征、環(huán)境化學(xué)行為與健康效應(yīng)、污染控制與修復(fù)等方面引起了極大關(guān)注。PAHs主要是化石燃料和生物質(zhì)不完全燃燒的產(chǎn)物。土壤PAHs污染來(lái)源廣泛，包括大氣干濕沉降、污水灌溉、化肥及農(nóng)藥施用、秸稈燃燒等。土壤是各種污染物的匯，同時(shí)在一定條件下可轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌h(huán)境介質(zhì)的二次污染源。PAHs排放量大，具有半揮發(fā)性、低溶解性、難生物降解性，常常在土壤中長(zhǎng)期存在、大量積累。我國(guó)2004年16種PAHs排放量約11.4萬(wàn)t，占全球總排放量的22%，是世界上釋放PAHs最多的國(guó)家。排放的絕大部分PAHs則沉積在我國(guó)境內(nèi)。自20世紀(jì)70年代以來(lái)，我國(guó)土壤PAHs污染的范圍不斷擴(kuò)大、污染日益嚴(yán)重，其濃度水平已從μg˙kg-1量級(jí)上升到mg˙kg-1量級(jí)，其檢出率從不到20%上升到80%以上。文獻(xiàn)將土壤PAHs濃度水平與污染程度劃分5種情況:0～200μg˙kg-1為無(wú)污染、200～600μg˙kg-1為輕污染、600～1000μg˙kg-1為污染、>1000μg˙kg-1為重污染。據(jù)此，我國(guó)已報(bào)道PAHs濃度水平的土壤中有78%受到PAHs污染，其中32%為重污染。通過(guò)土壤-植物系統(tǒng)遷移，PAHs對(duì)農(nóng)產(chǎn)品安全構(gòu)成嚴(yán)重威脅;經(jīng)食物鏈進(jìn)入人體，進(jìn)而影響到人類健康。因此，綠色修復(fù)土壤PAHs污染已成為國(guó)內(nèi)外環(huán)境和土壤界共同關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題之一。

PAHs污染土壤修復(fù)技術(shù)主要有化學(xué)修復(fù)、生物修復(fù)(植物修復(fù)、微生物修復(fù))、化學(xué)-生物相結(jié)合的修復(fù)等。微生物修復(fù)主要指采取強(qiáng)化措施以促進(jìn)微生物對(duì)土壤中有毒有害物質(zhì)的降解、轉(zhuǎn)化和去除，包括強(qiáng)化土著微生物降解(生物刺激)和投加外源高效降解微生物(生物強(qiáng)化)2種方式。微生物修復(fù)是研究最早、最深入、也是應(yīng)用最廣泛的一種生物修復(fù)技術(shù)，包括原位處理、生物接種、生物堆肥和生物反應(yīng)器等。作為一種綠色高效的修復(fù)技術(shù)，固定化微生物修復(fù)有機(jī)污染土壤正受到越來(lái)越多的關(guān)注。一方面，固定化微生物具有微生物密度大、反應(yīng)速度快、耐環(huán)境沖擊，顯著提高修復(fù)效率的優(yōu)點(diǎn);另一方面固定化微生物技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、要求低、成本低廉的特點(diǎn)。該技術(shù)有望克服投加到修復(fù)現(xiàn)場(chǎng)中的游離高效降解微生物與土著菌的惡性競(jìng)爭(zhēng)或難以適應(yīng)環(huán)境的問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)高效降解菌有效修復(fù)PAHs污染土壤。固定化微生物技術(shù)是從固定化酶技術(shù)發(fā)展起來(lái)，始于20世紀(jì)60年代，80年代開(kāi)始興起發(fā)展。固定化微生物技術(shù)在廢水處理中已有較多報(bào)道，但其在土壤修復(fù)特別是PAHs污染土壤修復(fù)的研究則剛剛開(kāi)始。在國(guó)內(nèi)，2006年蘇丹等提出了用固定化微生物修復(fù)受PAHs污染的非流體介質(zhì)(如土壤)的新技術(shù)，論述了其在非流體介質(zhì)中PAHs污染物原位修復(fù)的可行性和需要解決的關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題;也有學(xué)者概述了固定化微生物在污染土壤修復(fù)中的應(yīng)用。最近，國(guó)際上有關(guān)固定化微生物技術(shù)修復(fù)有機(jī)污染土壤逐漸增多。為此，本文從固定化微生物技術(shù)的修復(fù)原理、微生物固定化載體的選擇、高效降解菌的篩選、固定化方法及影響因素等方面，評(píng)述了近幾年國(guó)內(nèi)外有關(guān)固定化微生物技術(shù)修復(fù)有機(jī)污染土壤的最新進(jìn)展，并探討了今后的發(fā)展方向，以期為我國(guó)開(kāi)展固定化微生物技術(shù)修復(fù)有機(jī)污染土壤的研究提供參考。

1 固定化微生物技術(shù)的修復(fù)原理

固定化微生物技術(shù)主要是指通過(guò)物理或化學(xué)的方法將分散、游離的微生物固定在某一限定空間區(qū)域內(nèi)，以提高微生物細(xì)胞的濃度，使其保持較高的生物活性并反復(fù)利用的方法。固定化微生物技術(shù)最初主要應(yīng)用于生物反應(yīng)器中增加微生物分泌氨基酸、有機(jī)酸、抗生素等有用物質(zhì)或用作生物催化劑。有關(guān)固定化微生物技術(shù)在廢水污染治理中應(yīng)用受到越來(lái)越多的關(guān)注，一系列的細(xì)菌或真菌被固定于載體材料上用來(lái)處理廢水中的重金屬、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、酚類等污染物。近年來(lái)，研究者開(kāi)始關(guān)注應(yīng)用固定化微生物技術(shù)處理海水石油污染、降解環(huán)境中PAHs等有機(jī)污染物。Lin等利用海藻酸鈣凝膠包埋法固定Phanerochaete ysosporium和粉末活性炭，制得的微生物固定化材料用于降解五氯酚，該復(fù)合材料起生物催化劑、污染物吸附富集劑、微生物固態(tài)代謝底物等3種作用。

固定化微生物技術(shù)在PAHs污染土壤修復(fù)中的應(yīng)用則剛剛開(kāi)始，其主要的作用原理歸納總結(jié)如下:①利用載體材料提供的有利微環(huán)境作為緩沖體系，屏蔽土著微生物的競(jìng)爭(zhēng)作用和不利土壤條件的侵害作用，從而保證接種的高效降解微生物的良好生長(zhǎng);②同時(shí)，固定化載體作為吸附劑還可以有效地富集土壤中的PAHs，提高其在載體上的生物有效濃度;③此外，微生物及其分泌的胞外酶也被富集固定在載體上，增加了PAHs與高效降解微生物的接觸效率;④富集有高濃度PAHs的微生物固定化材料可成為土著微生物馴化的重要場(chǎng)所，聯(lián)合外源微生物進(jìn)一步修復(fù)PAHs污染土壤。具體過(guò)程見(jiàn)圖1所示。因此，固定化載體-微生物構(gòu)建起了降解PAHs的土壤微環(huán)境，大大加快了PAHs的去除。固定化技術(shù)不僅大大增加了接種微生物的數(shù)量和活性，同時(shí)也增加了微生物細(xì)胞的穩(wěn)定性，增強(qiáng)了其耐環(huán)境沖擊的能力，加快了微生物降解PAHs的反應(yīng)啟動(dòng)速度，從而增強(qiáng)了微生物去除土壤中PAHs的效率。另外，固定化材料還可以起到疏松劑的作用，加快氧氣的輸送，因而加速有機(jī)污染物的礦化作用。

土壤微生物吸附在土壤有機(jī)、無(wú)機(jī)顆粒上形成生物膜是一種普遍的自然現(xiàn)象，堆肥處理中活性污泥等有機(jī)質(zhì)都攜帶大量的微生物，對(duì)污染物去除有重要的作用。研究表明，固定化技術(shù)顯著增強(qiáng)微生物的環(huán)境適應(yīng)能力和污染物去除能力，大大提高土壤修復(fù)效果，是一項(xiàng)潛在的土壤修復(fù)技術(shù)。以聚乙烯醇、活性炭、海藻酸鈉為固定化載體，采用物理法和化學(xué)法包埋固定酵母菌，用于苯并[a]芘污染土壤的修復(fù)，結(jié)果表明，酵母菌經(jīng)過(guò)混合固定化包埋后，降解效果明顯好于游離菌，這是由于固定化載體內(nèi)部酵母菌密度明顯增加所致。同時(shí)，微生物作為一種含有多種官能團(tuán)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，經(jīng)固定化后其官能團(tuán)與載體之間發(fā)生共價(jià)鍵或范德華力等作用，主鏈結(jié)構(gòu)得到加固，不易流失和被破壞，能耐pH變化、有機(jī)污染物濃度的變化、生物毒性物質(zhì)等的沖擊，不易失活。用固定化真菌修復(fù)芘、苯并[a]芘污染土壤的實(shí)驗(yàn)表明，固定化技術(shù)顯著增強(qiáng)微生物耐環(huán)境沖擊性，在土壤pH4或9，溫度15℃或40℃以及重金屬Cd或Pb存在下，對(duì)固定化真菌降解芘和苯并[a]芘的影響很小，而游離菌對(duì)芘和苯并[a]芘的降解則顯著降低，表明固定化對(duì)脅迫環(huán)境具有屏蔽作用。很多研究表明，微生物固定化可以提高微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物酶的活性，增強(qiáng)對(duì)污染物的去除能力。其主要機(jī)制是固定化載體不僅作為微生物附著基質(zhì)，同時(shí)很多載體如植物殘?bào)w，可以作為固定化微生物生長(zhǎng)的介質(zhì)，促進(jìn)酶的產(chǎn)生。而在載體內(nèi)產(chǎn)生的酶吸附在載體中，增加了其與吸附在載體表面有機(jī)污染物接觸的機(jī)會(huì)，同時(shí)，載體存在的眾多孔道，也為酶的傳遞提供了更多的可能。

目前，有關(guān)固定化微生物修復(fù)PAHs污染土壤的研究大多集中在滅菌土壤上，而對(duì)于非滅菌土壤中投加的外源菌和土著菌對(duì)PAHs降解過(guò)程中的作用及關(guān)系的研究非常少;同時(shí)，更多關(guān)注模擬PAHs污染土壤的修復(fù)效果，而對(duì)于實(shí)際PAHs污染土壤的修復(fù)效果幾乎為空白。近年來(lái)，研究者對(duì)固定化真菌和細(xì)菌修復(fù)我國(guó)東北污灌區(qū)PAHs污染土壤進(jìn)行了一些探索。研究表明，不同的固定化載體和不同的固定化菌影響土壤中PAHs可萃取濃度(生物有效性)和降解率，進(jìn)而影響土壤中PAHs的修復(fù)效果。由于土壤環(huán)境本身的非均質(zhì)和復(fù)雜性，固定化微生物技術(shù)修復(fù)PAHs污染土壤的主要難題在于固定化載體的選擇以及適合于土壤修復(fù)的優(yōu)勢(shì)菌種的篩選，這也成為PAHs污染土壤固定化微生物修復(fù)關(guān)注的焦點(diǎn)。

2 微生物固定化載體的選擇

載體材料的性質(zhì)是影響固定化微生物活性、穩(wěn)定性及污染物去除效果的重要因素。雖然不同種類的細(xì)菌及同種細(xì)菌在不同環(huán)境條件下對(duì)載體材料的要求都有所區(qū)別，但應(yīng)用于廢水處理中的固定化載體一般都具有無(wú)毒、帶表面官能團(tuán)、傳質(zhì)效應(yīng)好、有較大比表面積、具有機(jī)械剛性、性能穩(wěn)定、不溶于水、抗生物分解、壽命長(zhǎng)、可重復(fù)使用、價(jià)格低廉、易獲取、易制備等共性。目前廢水處理應(yīng)用中的微生物固定化載體材料主要有無(wú)機(jī)載體、天然高分子凝膠載體和有機(jī)合成高分子凝膠載體、復(fù)合載體材料及一些新型載體材料。表1為不同類型載體材料的代表物質(zhì)以及其優(yōu)缺點(diǎn)。另外，一些新材料如納米材料被引進(jìn)固定化領(lǐng)域，取得不錯(cuò)的效果，為微生物載體選擇拓展了新領(lǐng)域。

由于土壤體系的復(fù)雜性和獨(dú)特性，土壤修復(fù)對(duì)載體材料要求的側(cè)重點(diǎn)與水體不同。土壤原位修復(fù)中一般不考慮固定化微生物載體的回收，固定化微生物載體施加進(jìn)入土壤后即成為土壤中的一部分，因此，土壤修復(fù)對(duì)載體材料的環(huán)境友好性的要求更加嚴(yán)格，尤其需要考慮載體材料對(duì)土壤污染物遷移轉(zhuǎn)化行為的影響。另外，載體材料在水體及土壤修復(fù)中所承擔(dān)的功能也是有所區(qū)別的。應(yīng)用于水體的載體材料主要是作為微生物的附著劑，從而提高微生物的穩(wěn)定性和局部密度，要求載體具有一定的強(qiáng)度和抗微生物分解能力。而土壤修復(fù)中的載體材料不僅是微生物的附著劑，同時(shí)，載體提供的微環(huán)境還是一個(gè)良好的緩沖體系，可以屏蔽土壤不利條件的侵害;最重要的是，載體必須為外源微生物提供充足的營(yíng)養(yǎng)，提高土壤微生物的密度和活性，所以，應(yīng)用于土壤修復(fù)中的載體材料應(yīng)具有一定的可生物降解性。因此，固定化微生物技術(shù)修復(fù)污染土壤中，選擇合適的載體材料至關(guān)重要。

微生物親和性、吸附能力、被富集污染物的生物有效性是評(píng)價(jià)固定化載體材料可行性的3個(gè)關(guān)鍵參數(shù)。現(xiàn)階段應(yīng)用于土壤中的固定化材料大多以聚乙烯醇、海藻酸鈉和活性炭為主，而對(duì)于其它固定化材料的研究則很少。植物殘?bào)w是一類廣泛存在于環(huán)境中的天然有機(jī)質(zhì)，是土壤有機(jī)質(zhì)組分的主要來(lái)源，含有豐富的C、N等營(yíng)養(yǎng)元素，對(duì)微生物和酶都具有很強(qiáng)的親和性;植物殘?bào)w腐殖化過(guò)程向土壤釋放的各種溶解性有機(jī)質(zhì)，其中很多是高環(huán)PAHs降解的共代謝底。向土壤添加植物殘?bào)w材料等天然有機(jī)質(zhì)可明顯改善土壤理化性質(zhì)，促進(jìn)土壤微生物活性和數(shù)量，增強(qiáng)PAHs去除，是一種潛在的固定化載體材料。用甘蔗渣、木屑、麥稈等常見(jiàn)的植物殘?bào)w固定微生物，可實(shí)現(xiàn)較高的酶產(chǎn)量和污染物去除能力。近年來(lái)，利用植物殘?bào)w類天然有機(jī)質(zhì)固定微生物去除水中PAHs等有機(jī)污染物已見(jiàn)報(bào)道，Gentili等用殼質(zhì)角素和殼聚糖作為載體材料固定紅球菌屬(Rhodococcus corynebacterioides)修復(fù)原油污染海水，發(fā)現(xiàn)固定化細(xì)菌對(duì)海水污染物的去除比游離菌提高了大約30%。用甘蔗渣固定白腐真菌(Phanerochaete ysosporium)大大提高了錳過(guò)氧化酶的活性和水體蒽的去除率。此外，稻稈、松針?lè)踋等都被證明是有效的固定化載體材料。有關(guān)利用天然有機(jī)質(zhì)材料固定微生物修復(fù)PAHs污染土壤的報(bào)道較少，但天然有機(jī)質(zhì)的潛在優(yōu)勢(shì)，如可以作為PAHs的天然生物吸附劑。Su等用玉米棒吸附固定真菌(Mucor sp.)修復(fù)苯并[a]芘污染土壤，發(fā)現(xiàn)固定化菌對(duì)環(huán)境適應(yīng)能力更強(qiáng)、反應(yīng)啟動(dòng)速度更快，苯并[a]芘去除效果更好。不同化學(xué)組成的植物材料對(duì)微生物降解PAHs有不同的影響，Dzul-Puc等分別以甘蔗渣和松針?lè)勰┳鳛辄S孢原毛平革菌(Phanerochaete ysosporium)的生長(zhǎng)基質(zhì)，并用于苯并[a]芘污染土壤的修復(fù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甘蔗渣組苯并[a]芘降解更快。采用植物殘?bào)w固定細(xì)菌修復(fù)PAHs污染土壤，結(jié)果表明植物殘?bào)w及其提取液可強(qiáng)化固定化菌和土著微生物去除PAHs。

固定化微生物技術(shù)修復(fù)PAHs污染土壤的效果取決于降解菌與污染物的可接觸性。微生物固定化技術(shù)明顯提高局部土壤微生物的密度和活性，但同時(shí)限制微生物向固定化顆粒外部發(fā)展，由于土壤中PAHs等有機(jī)污染物遷移能力較弱，所以往往只有與固定化微生物接觸的土壤得到有效修復(fù)。因此，為保證修復(fù)效果，必須經(jīng)常翻耕土壤，并多次投加固定化微生物，造成修復(fù)成本增加、處理難度加大，嚴(yán)重限制其實(shí)際應(yīng)用。一些高吸附性能的吸附劑可被用作固定化載體材料以解決上述缺陷。高吸附性能材料可促進(jìn)PAHs由土壤有機(jī)質(zhì)向固定化載體遷移，使固定化載體同時(shí)富集高濃度的微生物和土壤中的PAHs，增加PAHs與微生物的接觸，實(shí)現(xiàn)PAHs的富集-降解一體化，從而顯著促進(jìn)土壤修復(fù)效果。一些研究者用活性炭固定微生物并用于環(huán)境污染修復(fù)，取得較好的效果。但活性炭生產(chǎn)成本較高，其環(huán)境影響也有待進(jìn)一步研究。筆者所在課題組率先利用環(huán)境友好材料生物碳作為固定化基材，開(kāi)展了固定化微生物修復(fù)PAHs污染土壤。生物碳是一類由天然生物質(zhì)限氧裂解產(chǎn)生的富炭質(zhì)材料，在自然界中廣泛存在，具有很大的比表面積，對(duì)PAHs等有機(jī)污染物有很強(qiáng)的吸附能力，能大量富集污染物，促使污染物由土壤向生物碳遷移，從而提高微生物與污染物接觸的幾率。另外，生物碳是一類環(huán)境友好的材料，富含C、N等營(yíng)養(yǎng)元素，表面攜帶大量官能團(tuán)，能顯著改善土壤理化條件，其多孔性質(zhì)有利于微生物的附著生長(zhǎng)。利用生物碳固定微生物在農(nóng)業(yè)中已有廣泛應(yīng)用，關(guān)于其在土壤修復(fù)方面的應(yīng)用有待深入研究。

載體材料對(duì)PAHs的吸附作用及吸附態(tài)PAHs的生物有效性是影響固定化微生物對(duì)污染土壤修復(fù)效果的重要因素。植物殘?bào)w等天然有機(jī)質(zhì)對(duì)PAHs吸附主要以分配作用為主，脂肪碳和芳香碳是其吸附的主要組分。相比天然有機(jī)質(zhì)，生物碳對(duì)PAHs的吸附能力更強(qiáng)，吸附行為由表面吸附和分配作用所控制。生物碳制備條件尤其是裂解溫度對(duì)其吸附性能有重要的影響。一般認(rèn)為，隨制備溫度的增加，生物碳吸附能力逐漸增強(qiáng)，表面吸附作用貢獻(xiàn)增大，被吸附的PAHs生物有效性降低。吸附作用導(dǎo)致土壤PAHs向載體遷移、富集，明顯改變其遷移、轉(zhuǎn)化行為和生物有效性。傳統(tǒng)的研究認(rèn)為微生物不能直接利用顆粒吸附態(tài)的有機(jī)污染物，污染物必須首先從吸附顆粒上脫附下來(lái)進(jìn)入土壤溶液才能被微生物降解，所以，吸附作用實(shí)際上降低了土壤污染物的生物有效性，使土壤成為有機(jī)污染物重要的儲(chǔ)存庫(kù)。但也有研究認(rèn)為，微生物可以直接利用顆粒吸附態(tài)的污染物，利用效率主要與顆粒的表面結(jié)構(gòu)、化學(xué)性質(zhì)及碳結(jié)構(gòu)與微生物親和性有關(guān)。Yang等研究了土壤有機(jī)質(zhì)對(duì)菲吸附作用和降解行為的影響。他們發(fā)現(xiàn)隨著土壤有機(jī)碳含量的增加(0.23%→7.1%)，土壤溶解性菲含量急劇下降[(28.63±2。15)μ

g˙L-1→(0.79±0.04)μg˙L-1]。但接種細(xì)菌(Mycobacterium vanbaalenii PYR-1)培養(yǎng)216h后，不同有機(jī)碳含量土壤中菲降解量并無(wú)顯著變化，且土壤菲殘留量都明顯的低于模型預(yù)測(cè)值(模型認(rèn)為微生物只能利用溶解態(tài)PAHs)，說(shuō)明吸附態(tài)PAHs可以被微生物直接攝取利用。有研究認(rèn)為微生物主要先利用土壤溶液中的PAHs，然后對(duì)吸附態(tài)PAHs進(jìn)行降解，其降解效率主要與土壤有機(jī)碳含量和土壤孔隙率有關(guān)。對(duì)木質(zhì)素、蠟質(zhì)、纖維素吸附態(tài)菲的細(xì)菌降解實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)30d后，蠟質(zhì)吸附態(tài)菲和纖維素吸附態(tài)菲分別被降解49.6%±0.6%和54.7%±3.4%，大大高于19.7%和39.0%的模型預(yù)測(cè)效果，說(shuō)明大約有30%的蠟質(zhì)吸附態(tài)菲和15%的纖維素吸附態(tài)菲是通過(guò)微生物直接攝取被降解的;實(shí)驗(yàn)中只有1.2%±0.2%的木質(zhì)素吸附態(tài)菲被降解，說(shuō)明木質(zhì)素的吸附作用顯著的降低了PAHs的生物有效性。微生物在有機(jī)質(zhì)表面附著生長(zhǎng)是其利用吸附態(tài)污染物的關(guān)鍵步驟，蠟質(zhì)疏水表面對(duì)微生物的強(qiáng)親和性是蠟質(zhì)吸附態(tài)菲生物有效性較高的主要原因。因此，在固定化微生物修復(fù)PAHs污染土壤時(shí)，表面蠟質(zhì)含量或疏水性等參數(shù)是選擇載體材料的重要依據(jù)。

3 固定化微生物及高效降解菌的篩選

固定化微生物修復(fù)技術(shù)是載體與微生物共同作用的結(jié)果，微生物性質(zhì)對(duì)土壤修復(fù)效果有重要的影響。用于PAHs污染土壤修復(fù)的微生物包括土著菌、外來(lái)高效菌和基因工程菌。表2列出了固定化微生物、固定化載體、固定化方法及其對(duì)PAHs污染土壤的修復(fù)效果的影響。不同的微生物固定化后對(duì)PAHs的降解存在很大的差異性。從表2可見(jiàn)，在細(xì)菌、真菌以及它們種內(nèi)和種間聯(lián)合作用條件下(以PAHs典型代表物芘為例)，單細(xì)菌對(duì)土壤中芘的去除率較差，最 佳的降解菌種是動(dòng)膠桿菌(Zoogloea sp.)9號(hào)，去除率為52.7%;單真菌對(duì)芘的去除效果普遍高于單細(xì)菌，最 佳的降解菌種是鐮刀菌(Fusarium sp.)，去除率達(dá)到了69%。單種微生物對(duì)PAHs表現(xiàn)出一定的降解能力，但眾多研究表明，菌種的種內(nèi)聯(lián)合或種間聯(lián)合降解往往優(yōu)于單個(gè)菌種的降解能力。對(duì)2種細(xì)菌芽孢桿菌(Bacillus sp.)2號(hào)和動(dòng)膠桿菌(Zoogloea sp.)9號(hào)聯(lián)合降解芘研究表明，兩菌聯(lián)合降解的效果好于單菌種，對(duì)芘的降解率為61.8%;而2種真菌的聯(lián)合降解效果更好，黑曲霉和鐮刀菌在對(duì)初始濃度為100mg˙kg-1芘的降解率達(dá)到了81%。由此可見(jiàn)，在固定化微生物修復(fù)PAHs污染土壤中，聯(lián)合菌種降解能力高于單個(gè)菌種;而在單菌種對(duì)PAHs的降解中，真菌的降解能力普遍高于細(xì)菌。然而，大部分研究結(jié)果是在土壤滅菌條件下獲得的，與現(xiàn)實(shí)不滅菌的土壤條件有差別。最近有學(xué)者研究了固定化微生物投加到不滅菌的PAHs污染土壤中的修復(fù)效果，結(jié)果表明，加入松針生物碳固定化菌后，東北污灌區(qū)污染土壤中16種PAHs的可萃取濃度和可萃取率均顯著降低，并且隨著生物碳炭化溫度升高而降低;生物碳固定化菌可以降解吸附的PAHs，篩選的高效土著菌能有效的利用生物碳固定化菌吸附的PAHs。由此可見(jiàn)，相對(duì)于外源菌，篩選的土著高效菌對(duì)PAHs的降解具有天然的優(yōu)勢(shì)。因此，篩選具有高降解性能的土著菌用于固定化微生物修復(fù)PAHs污染土壤是一種環(huán)境友好的選擇。

固定化微生物能否有效利用載體吸附態(tài)PAHs是修復(fù)成功的關(guān)鍵因素。微生物在載體表面附著生長(zhǎng)可增加微生物與吸附態(tài)PAHs的接觸機(jī)會(huì)，從而促進(jìn)微生物對(duì)PAHs的降解作用。研究表明，具疏水性表面的微生物更容易附著在各類載體材料的表面，故而可能是一種更加有利的選擇。直接用吸附態(tài)PAHs來(lái)篩選、馴化微生物，可望得到能高效利用吸附態(tài)PAHs的菌種，對(duì)微生物固定化技術(shù)的成功應(yīng)用有重大意義，以解決溶液馴化高效菌在固定時(shí)難以達(dá)到同樣降解效果的難題。Bastiaens等將過(guò)量的PAHs加入無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中篩選獲得分支鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas sp.)，同時(shí)將PAHs吸附在一種疏水性材料膜上作為碳源篩選得到分枝桿菌屬(Mycobacterium sp.)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分枝桿菌屬(Mycobacterium sp.)具有更強(qiáng)的疏水性，更易在各種不同材料表面附著生長(zhǎng)。Vacca等分別用溶液態(tài)菲和腐殖酸吸附態(tài)菲篩選獲得菲降解菌，發(fā)現(xiàn)只有通過(guò)吸附態(tài)菲篩選獲得的微生物具有直接礦化顆粒吸附態(tài)菲的能力。不同材料吸附態(tài)PAHs作為碳源可篩選得到不同種類的微生物，F(xiàn)riedrich等用聚丙烯樹(shù)脂吸附態(tài)菲篩選得到分枝桿菌屬(Mycobacterium)，而用安伯來(lái)特樹(shù)脂吸附態(tài)菲卻得到洋蔥伯克霍爾德菌(Burkholderia sp.)，說(shuō)明不同微生物對(duì)不同載體吸附態(tài)PAHs有不同的生物有效性。有關(guān)篩選、馴化高效微生物大多局限在液體環(huán)境下，馴化的環(huán)境與吸附態(tài)PAHs的降解環(huán)境條件相反，增加了微生物適應(yīng)的時(shí)間，減慢了固定化微生物的反應(yīng)速度。而采用高吸附性能材料富集PAHs作為碳源篩選得到菌種，使微生物從一開(kāi)始就處于“工作”的環(huán)境，減少了微生物反應(yīng)時(shí)間，經(jīng)過(guò)“熱身”的微生物，為更快地投入降解修復(fù)打下基礎(chǔ)。因此，利用強(qiáng)吸附能力的材料富集PAHs作為碳源篩選菌種是固定化微生物研究的重要突破方向。

固定化微生物另一個(gè)來(lái)源是引進(jìn)外來(lái)微生物，外來(lái)微生物是強(qiáng)化多環(huán)芳烴污染土壤修復(fù)的重要手段，特別是在自然條件下，固定化外來(lái)微生物可以加快污染物的去除。研究結(jié)果表明，在自然土壤中加入初始濃度為100mg˙kg-1的芘、苯并[a]芘，培養(yǎng)10d后，固定化單菌添加組對(duì)芘、苯并[a]芘去除率分別為49%～69%、29%～37%，明顯高于游離菌添加組;固定化混合菌添加組對(duì)芘、苯并[a]芘去除率更是高達(dá)81%和43%。作為PAHs的高效降解菌種，固定化黃孢原毛平革菌(Phanerochaeteysosporium)修復(fù)PAHs污染土壤引起了研究者的廣泛關(guān)注。研究表明，用甘蔗渣固定黃孢原毛平革菌(Phanerochaete ysosporium)大大提高了錳過(guò)氧化酶的活性和水體蒽的去除率。Dzul-Puc等分別以甘蔗渣和松針?lè)勰┳鳛辄S孢原毛平革菌(Phanerochaete ysosporium)的生長(zhǎng)基質(zhì)，用于苯并[a]芘污染土壤的修復(fù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加入甘蔗渣和松針?lè)勰┒伎梢源龠M(jìn)土壤中苯并[a]芘的去除，其最大去除率(BaP/干土)分別為50.12mg˙kg-1和39.94mg˙kg-1。

4 微生物固定化方法及其它影響因素

固定化載體和高效降解菌是固定化微生物技術(shù)的2個(gè)重要支撐，而固定化方式是協(xié)調(diào)2個(gè)支撐的關(guān)鍵媒介。固定化方式可以極大地影響微生物的生長(zhǎng)和代謝，進(jìn)而影響修復(fù)效果。主要的固定化方式有吸附法、包埋法、交聯(lián)法、共價(jià)結(jié)合法，微生物自身固定化以及組合固定化技術(shù)等。表3中列出了各種固定化方法的性能比較。交聯(lián)法雖然結(jié)合牢固，穩(wěn)定性好，但操作比較復(fù)雜，反應(yīng)條件激烈，容易導(dǎo)致微生物失活，故不常使用。吸附法和包埋法是應(yīng)用最廣泛的固定化方法。吸附法操作簡(jiǎn)單，對(duì)細(xì)胞活性影響小，但固定微生物數(shù)量和強(qiáng)度受載體影響大，且效果不穩(wěn)定。包埋法可以實(shí)現(xiàn)高濃度的微生物固定，且微生物與載體聯(lián)結(jié)強(qiáng)度較高，但包埋過(guò)程剪切力會(huì)導(dǎo)致微生物細(xì)胞失活。在固定化微生物修復(fù)PAHs污染土壤中，研究者大多采用吸附法和包埋法。

有學(xué)者分別用物理法和化學(xué)法包埋固定酵母菌修復(fù)苯并[a]芘污染土壤，結(jié)果表明，物理法效果普遍優(yōu)于化學(xué)法，物理包埋法苯并[a]芘半衰期為5.66～8.49d，化學(xué)法為6.56～9.32d，比游離菌組有不同程度降低(7.40～12.03d)。為克服單一固定化技術(shù)的缺陷，組合固定化技術(shù)被關(guān)注。吸附-包埋聯(lián)合固定化技術(shù)是一種重要的組合固定技術(shù)，首先將微生物與載體材料充分混合，使微生物盡可能的附著在載體材料上，然后用海藻酸鈉等凝膠劑將混合液包埋固定。吸附-包埋聯(lián)合固定化技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)高濃度的微生物固定和較高的固定化強(qiáng)度，同時(shí)由于吸附過(guò)程載體材料提供的微環(huán)境和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，很好地解決了包埋過(guò)程微生物失活的問(wèn)題。

除了固定化方法對(duì)固定化微生物性能有影響之外，固定化過(guò)程中各種條件參數(shù)也影響其環(huán)境修復(fù)效果。固定化時(shí)間和載體用量是固定化過(guò)程中2個(gè)重要的參數(shù)，對(duì)固定化顆粒韌性、微生物活性、微生物與載體結(jié)合強(qiáng)度都有顯著的影響。莢榮等研究發(fā)現(xiàn)，固定化時(shí)間是影響固定化白腐真菌F17對(duì)多種染料降解效果的主要因素，菌絲與載體結(jié)合2d，白腐真菌對(duì)染料金橙G和剛果紅具有最 佳脫色率。Tao等比較了海藻酸鈉濃度對(duì)包埋固定化效果的影響，發(fā)現(xiàn)在3%海藻酸鈉添加濃度下得到的固定化細(xì)菌(Sphingomonas)顆粒在塑形、強(qiáng)度、韌性、通透性等方面均有較好的表現(xiàn)。

5 結(jié)論與展望

固定化微生物技術(shù)以其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和巨大的應(yīng)用潛力在廢水處理領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。但其在土壤修復(fù)中的研究則剛剛起步，其實(shí)用化傾向即大規(guī)模實(shí)際應(yīng)用特征非常明顯。要實(shí)現(xiàn)其規(guī)模化應(yīng)用還有許多問(wèn)題急需解決:①獲得適宜于土壤的固定化載體，應(yīng)用于土壤修復(fù)的微生物固定化載體應(yīng)具有環(huán)境友好、性能穩(wěn)定、成本低廉、微生物親和性好、污染物吸附能力強(qiáng)的特點(diǎn);植物殘?bào)w類的天然有機(jī)質(zhì)、生物碳類的炭質(zhì)材料以及農(nóng)業(yè)有機(jī)廢棄物等具有明顯的優(yōu)勢(shì)，是潛在的載體選擇。②高效降解菌的篩選，采用疏水性表面的微生物更容易附著在各類載體材料的表面，直接用吸附態(tài)PAHs來(lái)篩選、馴化微生物，可望得到能高效利用吸附態(tài)PAHs的菌種或菌群。因此，利用吸附態(tài)PAHs作為碳源篩選獲得能直接降解吸附態(tài)PAHs的高效降解菌是微生物固定化技術(shù)成功應(yīng)用于土壤修復(fù)的另一個(gè)突破口。③采用合適的固定化方法，固定化方法應(yīng)實(shí)現(xiàn)固定化微生物的高濃度、高活性、與載體結(jié)合強(qiáng)度高、性能穩(wěn)定以及增強(qiáng)吸附固定作用等要求。吸附法和包埋法是應(yīng)用廣泛的固定化方法，但都存在一定的缺陷，吸附-包埋聯(lián)合固定化技術(shù)可能是未來(lái)的一個(gè)重要選擇。④固定化微生物的穩(wěn)定性、持久性、安全性還有待進(jìn)一步研究，同時(shí)，固定化微生物施入土壤后的激活以及調(diào)控機(jī)制還需要更多的探索。⑤與其他修復(fù)技術(shù)的聯(lián)合使用，如用表面活性劑促進(jìn)PAHs從土壤有機(jī)質(zhì)中解吸出來(lái)，增加其流動(dòng)性，提高其生生物可利用性。